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快速实时的PCR检测---赛多利斯实验室

[2019/4/15]

快速实时的PCR检测---赛多利斯实验室

支原体是世界上最小的能够独立繁殖的细菌之一。它们属于柔膜细菌目(Mollicutes),具有非常缓慢的寄生生长方式。支原体可引起动物和植物体内的众多感染现象。

快速实时的PCR检测

用于支原体DNA敏感检测的实时PCR技术

本文以使用Vivaspin® 20 超滤管进行DNA分离,用Microsart® AMP进行支原体检测为例。基于PCR的检测试剂盒为用户提供可靠、稳定的检测结果,耗时只需3小时,该方法简易且经济、即取即用、灵敏度高。

支原体没有细菌所具有的细胞壁,也就没有抗体的攻击点,因而非常难以控制。鉴于此,使用传统的除菌过滤器(0.2μm孔径)对支原体实现完全截留。不可忽视的是,支原体的细胞大小为0.5-0.8μm,同时具有极大的灵活性和变形能力,能够通过除菌滤器。

支原体检测

检测支原体污染的方法有许多种。以生长法举例,在特定液体或固体的营养培养基中进行培养,或通过荧光显微镜的方式进行检测等都是非常普遍的方法。在目前的“金标准”里,生长检测需要至少有28天的培养时间,然后使用这些可用排除法确定并且缓慢生长的细菌进行污染。在此阶段中,样品必须要在白天可肉眼检测,而这也需要大量的时间。

即使采用荧光显微镜进行辅助检测,依然需要至少8天的时间来排除鉴定支原体的感染。另外,操作者需要经过专门培训,拥有丰富的经验,并知道特殊知识,才可有能力排除对结果的干扰。

“3-小时”替代法

基于PCR的检测试剂盒(如赛多利斯公司的Microsart®  AMP支原体试剂盒)可为用户提供灵敏、稳定的检测结果,耗时只需3小时。该方法简易且经济、试剂盒即取即用。试剂盒上仅需要一个能够检测荧光染料FAM和ROX的实时PCR仪即可。该PCR试剂盒适用于各种各样的初始样品。配合使用Vivaspin® 20或Vivaspin® 6超滤管,则可处理高达18ml的样品体积,从而确保高的灵敏度。
实验部分

下面所述的是一个使用Vivaspin® 20超滤管进行DNA分离并用Microsart® AMP进行支原体检测的案例。

Mycoplasma fermentans于37℃在Hayflick培养基中进行培养,直至酚红指示剂颜色发生轻微的改变,然后将其用1xPBS(磷酸盐缓冲液)以1:1000的比例进行稀释。用移液器将18ml的稀释样品平均加入至每个Vivaspin® 20超滤管。为了中和非特异性化合物,在每份样品中添加2ml的包被缓冲液。然后以3500x g的转速离心20分钟,直至浓缩后的剩余体积约为200μl。在200μl裂解缓冲液的协助下,将全部浓缩物转移至一支新的1.5ml反应管中。缓冲液是用于冲洗Vivaspin® 20超滤管,以确保样品被完全彻底地转移。将200μl浓缩样品和200μl裂解缓冲液组成的混合物在56℃孵育15分钟,以促使细胞完全裂解。在该步骤之后,使用浓缩管将DNA分离。在DNA分离过程中,采用Microsart® AMP提取试剂盒,并根据试剂盒说明书进行操作。几乎全部分离的DNA都要用于实时PCR(60μlDNA洗脱液中的50μl),以达到最大的敏感度。

平行测试中,在不经过Vivaspin® 浓缩步骤的情况下,取相同初始量的DNA进行分离,以对经过浓缩和未经过浓缩的样品进行直接对比。

根据试剂盒说明书操作,PCR反应步骤如下:

 

将试剂盒中反应管与冻干成分一起以最大速度离心5秒,将1275μl的缓冲液添加至引物/探针/核苷酸混合物(红帽)中。

 

300μl水(PCR质量级别)添加至阳性对照(绿帽)和内参对照(黄帽)中。

 

在室温下孵育5分钟,直至完全混合。

 

将溶液和Vortex混合物简单混合,并快速离心。

 

主混合物(Master Mix)的组成:每次均将49μl的引物/探针/核苷酸混合物(红帽)和1μl的内参对照(黄帽)进行反应,移液并混合至一支1.5ml的反应离心管中。

 

50μl主混合物和50μl样品或阳性对照或阴性对照液(比如:洗脱缓冲液,PCR水,或者10mM Tris缓冲液)移液至200μl的PCR管中,并插入至经过预设程序的实施热循环仪中。

将浓缩样品的Ct值(循环阈值)与未浓缩样品持续进行比较。Ct值是当荧光信号达到某个设定的阈值时所经历的扩增循环数。表1列出了每一个Ct值。表2所示的是平均ΔCt值,即表1和使用或者未使用包被缓冲液样品之间的Ct值之差。ΔCt值的测定为:ΔCt-Ct(未经Vivaspin浓缩的样品)-Ct(浓缩样品)。

 

与包被缓冲液一起进行共同浓缩后,Mycoplasma fermentans可达到ΔCt>7的Ct差值。当没有使用包被缓冲液(个值未列出)时,记录的ΔCt值为稍低一点的6,尽管这一结果可能是由于Vivaspin® 超滤管的离心时间更短而造成的。不过,它仍然显示了在灵敏度上有了显著的提高。

 

灵敏度以及时间等参数对于支原体污染的调查而言是至关重要的。在浓缩步骤中,这些参数在PCR试剂盒中都会有详细描述。通过使用Vivaspin® 20,Ct值可提高到ΔCt>7,相应的灵敏度可以增加大约2 log的水平。这使得Microsart® AMP检测试剂盒和Vivaspin® 20能够成为经济、有效又实用的快速支原体检测工具

实验结果与讨论

使用TaqMan® 探针进行实时 qPCR 能够检测支原体的DNA,起始体积 200 μl -18 ml。通过qPCR 循环对样本DNA进行扩增,通过软件系统得到试验结果。